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○ RCA (rolling circle amplification) 기술은 바이오센서 및 바이오분석 응용 분야에서 널리 사용되지만, 고효율 증폭을 위한 다양한 RCA 변형 기술의 개발은 여전히 중요한 과제임. ○ 본 발명에서는 질병 관련 마이크로RNA(microRNA)를 민감하고 선택적으로 검출하기 위해 덤벨 구조의 DNA 템플릿(DBTP)을 사용한 토홀드 매개 RCA (toehold-mediated RCA, TRCA) 기술을 개발함. 추가로, TRCA 산물(amplicon)에 결합하는 역 프라이머(reverse primer, Pr)와 TRCA amplicon의 특정 서열을 인식하여 nick 부위를 형성하는 nicking endonuclease (nE)를 도입하여 3종의 변형된 TRCA 기술을 개발함(hyperbranched TRCA, HTRCA; nicking-assisted TRCA; NTRCA, hyperbranched NTRCA; HNTRCA). ○ 본 발명에서 사용된 DBTP는 2개의 loop와 1개의 stem 서열로 구성되며, 각 loop에는 표적 miRNA와의 특이적 결합을 위한 toehold 영역과 nE에 의해 인식되는 특정 염기서열이 포함됨. 이러한 템플릿은 안정적인 덤벨 구조를 유지하다가 표적 miRNA와의 결합으로 토홀드 매개 가닥 변위(toehold-mediated strand displacement)가 촉발되며, TRCA 반응을 개시함. ○ TRCA 반응은 선형 증폭을 유도하지만, Pr과 nE를 각각 또는 함께 도입한 3종의 변형 TRCA 기술(HTRCA, NTRCA, HNTRCA)은 지수함수적 증폭을 유도하여 짧은 시간 내에 고수율의 증폭 산물을 획득할 수 있음. ○ 따라서 이 3종의 변형 TRCA 기술은 혈액, 혈장, 소변, 타액, 눈물 등 다양한 생물학적 시료에서 극미량으로 존재하는 질병 관련 표적 RNA 바이오마커를 선택적으로 인식하고 고효율로 증폭할 수 있는 유용한 기술로, 다양한 질병 마커의 검출에 활용될 수 있음.

○ 다양한 핵산효소(역전사, 분해, 중합 효소)를 이용하여 1시간 이내 높은 선택도와 민감도로 검출할 수 있는 등온 핵산증폭기술을 개발함. ○ 기존 RT-LAMP 기술과 유사하게 역전사반응(RT)과 등온 증폭기술을 동시에 일으키는 기술로 타겟 RNA로부터 cDNA를 합성하고, 두 개의 프라이머 및 핵산 분해 효소의 인식으로 cDNA 염기서열과 무관하며 조절 가능한 염기서열을 가진 DNA 절편(fragment)를 생성함. 이 과정은 55~60도 사이의 등온에서 이루어지며, 사용된 프라이머가 재사용되면서 단일 cDNA 만으로 무수한 DNA 절편을 생성하는 첫번째 등온증폭기술이 적용됨. ○ 이후 DNA 절편은 또 다른 등온 증폭과정에 의해 수천개 반복된 염기서열을 가진 DNA 가닥으로 신장(elongation)되며(55~60도 반응), 이렇게 증폭된 DNA 산물은 형광, 비색 검출을 통해 검출하는 시스템임. ○ 기존 RT-LAMP 기술 대비 고선택도를 자랑하며, RT-qPCR과 다르게 타겟 유전자와 무관한 염기서열을 증폭시키므로 증폭과정에서 사용되는 주형 DNA(template DNA)는 다른 타겟 유전자에 폭넓게 사용될 수 있음. 뿐만 아니라 별도의 워싱 또는 정제 스텝이 요구되지 않으며, 두번의 연속적인 핵산증폭기술을 적용하여 진단민감도를 크게 개선할 수 있음.