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MicroRNA(miRNA)는 중요한 질병 바이오마커로 활용되며, 이들의 검출에는 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)이 여전히 표준 기술로 사용되고 있다. 그러나 기존 방법들은 온도에 민감한 효소에 의존하기 때문에 실험 간 변동성과 보관의 어려움이 따른다. 본 연구에서는 이러한 한계를 해결하고자, 효소를 사용하지 않는 miRNA-스플린트 기반 DNA 연결 반응을 위해 아민-아민 크로스링킹을 이용한 화학적 DNA 라이게이션 전략을 제시한다. 또한 대안적 접근을 탐색하기 위해, 본 연구에서 개발한 방법을 구리 촉매 기반의 **아자이드-알카인 클릭 반응(copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition, CuAAC)**을 이용한 효소 비의존적 화학적 DNA 라이게이션과 비교하였다. 그 결과, bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3) 매개 방식은 금속 촉매 없이도 넓은 온도 범위에서 작동하며, 연결된 DNA 가닥 사이에 11.4 Å의 일정한 간격을 유지하는 등 우수한 성능을 보였다. 두 가지 화학적 방법 모두 이후 단계의 PCR 증폭과 완전한 호환성을 보여, 기존 qPCR 분석 흐름에 무리 없이 통합될 수 있었다. 이들 화학적 플랫폼은 효소 관련 변동성을 제거하고, 냉장 보관 없이도 시약의 안정성을 향상시키며, 반응 프로토콜을 단순화한다. 특히 BS3 기반 접근법은 qPCR 기반 miRNA 검출에서 요구되는 감도와 특이성을 유지하면서도, 기존 효소 기반 라이게이션보다 더욱 안정적이고 재현성이 높은 대안을 실험실에 제공한다.